双歧酸奶定量干燥菌种的实验室研究

双歧酸奶定量干燥菌种的实验室研究黄勇，张德纯，马展张莉艳（重庆医科大学医学检验系，重庆400016）歧杆菌、乳杆菌、嗜热链球菌），并采用真空冷冻干燥技术进行处理，从而对干燥效果以及常温保存活性进行评价和分析。结果：三种乳酸菌的干燥菌粉活菌计数均大于1012个/g；凝乳试验显示次代菌种发酵时间明显低于代；混合发酵的凝乳中活菌计数均大于106个/ml，单一菌种发酵的凝乳中活菌计数超过1010个/ml；干燥菌种在37°C放置30d后，活菌数仍可达108个/g以上。结论：双歧酸奶定量干燥菌种实验室研宄结果令人满意，为开发双歧酸奶袋装式干燥菌种打下了基础。
作为发酵启子的微生物菌种，在食品发酵工业中占有举足轻重的地位。菌种的质量直接影响产品的质量。在发酵过程中，因为连续传代使用的菌种有可能被噬菌体或杂菌等污染，导致发酵的失败甚至产品报废，给企业造成巨大的经济损失。而且，连续传代的菌种还有可能发生各种变异影响产品的质量。因此，生产用菌种必需定期更换。本文对双歧酸奶定量干燥菌种的实验室研究进行了初步探讨，以便为开发出简便、经济、实用的双歧酸奶袋装式干燥菌种打下基础。
1材料与方法1.1菌种保加利亚乳杆菌（6032）、嗜热链球菌（6038），均为本研究室保存。两歧双歧杆菌：分离自健康儿童粪便，经形态、生化等鉴定为两歧双歧杆菌，编号为021206. 10g，牛肉霄10g，酵母霄5g，枸橼酸三铵0.05g，葡萄糖20g，蒸馏水1 2~6.4，121*C高压灭菌15min.MRS固体培养基：MRS液体培养基中加入1.5的琼脂。发酵培养基：含牛奶、豆浆、蔗糖、低聚糖等成分，由重庆海浪生物乳业有限公司提供。
1.3实验方法本研究的工艺流程为；细菌的培养及收获+加冻干保护剂+预冻+真空干燥+干燥效果评价+常温保存活性观察。
1.3.1细菌的培养与收获将过夜培养的6032、6038、21206按2接种量分别接种到装有50mlMRS液体培养基的50ml离心管中，37 *C静置培养0.5~0.6.4°C以30001/min离心10min，收获菌体沉淀，并用冰冷的生理盐水洗涤一遍。
1.3.2细菌的干燥在收获的菌泥中加入等量的新鲜脱脂牛奶作冻干保护剂，混匀。于-70*C急冻2h或液氮急冻10min.将预冻好的菌泥迅速移至己充分预冷（-50*C以下）的冷冻真空干燥器中，真空冷冻干燥6~8h至菌泥完全干燥，然后直接进行干燥菌粉活菌计数及凝乳效果测定等实验。
1.3.3干燥菌粉活菌计数采用平板滴注法。称量6032、6038、021206冻干菌粉的重量（记为M g），加入1ml生理盐水溶解混匀，并作系列稀释（101至109），然后取各稀释度菌液20W滴注MRS平板，每个稀释度滴3滴并均匀涂布，37 *C厌氧培养2d后根据菌落可数性选择计数菌落数较适宜的稀释度，并计数菌落个数。活菌数计算方法：每克菌粉含活菌数=每滴平均菌落数x50x稀释倍数+M. 1.3.4干燥菌粉凝乳效果测定及凝乳中乳酸菌活菌计数1.3.3.1混合干燥菌种发酵效果观察及活菌计数按每公斤发酵培养基接种三种干燥菌种（02120660326038= 63：1）共50mg，即每吨接种50g干燥菌粉，然后于42*C静置培养。观察并记录发酵培养基凝乳时间。
采用平板滴注法计数凝乳中的活菌数。将凝乳充分混匀，吸取0.5ml凝乳用无菌生理盐水作系列稀释（10 1至109），稀释过程中用旋涡震荡器充分震荡混匀。然后取各稀释度菌液20W滴注MRS平19-宄C现广州市儿医！检验ik！102e0cPublisf每个稀6度滴1滴并均匀养2d后计数菌落个数。根据菌落形态的不同可区分凝乳中的三种乳酸菌并分别计数。活菌数计算方法：每亳升凝乳中各菌活菌数=每滴平均菌落数x 50x稀释倍数x2. 3.3.2单一干燥菌种发酵效果观察及活菌计数021206干燥菌粉50mg，然后于42*C静置培养。观察并记录凝乳时间。发酵乳中所含乳酸菌活菌计数方法同上。
3.3次代发酵效果观察及活菌计数将混合发酵和021206、6032单一干燥菌种发酵的凝乳分别再按5的比例接种传第2代，观察发酵培养基凝乳所需时间。发酵乳中所含乳酸活菌计数方法同上。
3.4保质期观察按前述方法培养及处理三种菌种，加保护剂后分装于冷冻真空干燥菌种管中，-70*C预冻，真空冷冻干燥，封口。于37中放置0d、10d、20d、30d后分别测定干燥菌粉中的活菌数。
2结果21干燥菌粉活菌计数根据菌落可数性选择访8稀释度（双歧杆菌选访7稀释度）计数菌落数。
结果三种菌活菌数均比较高，双歧杆菌1.05x1012个/g菌粉，乳杆菌6.2x1012个/g，嗜热链球菌7. 2干燥菌粉凝乳效果测定按50克/吨接种量混合接种021206、6032、6038三种菌的干燥菌粉共*C静置培养，凝乳时间约需5~该凝乳按5接种量再接种发酵培养基，第2代凝乳仅需1.8~2h.双歧杆菌单一干燥菌种发酵代需20~ h，第2代需12~ 14h.乳杆菌单独发酵代约需7h，第2代需2h.嗜热链球菌单独发酵代约需5h，第2代仅需1.5h. 23凝乳中乳酸菌的活菌计数混合菌种发酵代凝乳后，双歧杆菌活菌数达2.5x106个/ml，乳杆菌6.0x混合菌种发酵第二代，双歧杆菌活菌数达1.05x双歧杆菌单一菌种发酵代活菌计数约1.独发酵代为2.1x1010个/ml；嗜热链球菌单独发酵代为5.1x1010个/ml. 24保质期观察结果见表1.表1保质期观察（个/g）菌种双歧杆菌乳杆菌嗜热链球菌3讨论乳酸菌在很早以前就被人类作为食品微生物，并广泛应用于发酵乳制品、豆制品、肉制品等。
在生产过程中，菌种保存的好坏与发酵产品的质量ub直接相关。
我们采用冷冻真空干燥技术15，对双歧酸奶定量干燥菌种的实验室研究作了初步探讨，对细菌的培养、收获、干燥、发酵效果及储存保质期等作了初步研究，达到了较满意的效果。每克干燥菌粉中活菌数均达1012以上，其中双歧杆菌为1. 1012个/克菌粉，乳杆菌为6.2x1012个/克菌粉，嗜热链球菌为7.6x1012个/克菌粉。双歧杆菌低于后两种细菌，可能与双歧杆菌为厌氧菌，在培养及干燥过程中与空气接触而受到影响有关，也有可能与双歧杆菌培养的菌龄、保护剂等因素有关。我们按50克/吨发酵培养基混合接种干燥菌粉，需5~6h凝乳，但次代接种仅需2h，可能是由于干燥后的菌种处于休眠期。混合发酵凝乳中的活菌数均高于106个/ml，其中双歧杆菌为2.5x106个/ml，乳杆菌为6.0x107个/ml，嗜热链球菌为5.5x1010个/ml.乳杆菌和双歧杆菌活菌数比例较低，可能与几种细菌复苏时间不一致所致。以双歧杆菌单一菌种发酵活菌数则可达1010个/ml.将该菌种真空包装后置37 *C存放30d，活菌数仍达108~有多个因素都对菌种冷冻真空干燥后的存活率产生影响。（1）菌种本身：有学者研究发现，不同菌种在冷冻干燥之后的存活率存在差异，因此针对不同菌种选用不同冻干条件是必要的。（2）菌龄：通常对数生长末期和稳定早期收获的细菌，其冻干存活率高于稳定期后期。（3）pH值：培养基的pH值对细菌的生长及活性影响也很大，pH值在6. 0~6.5时三种菌生长好，故在培养过程中应控制培养基的pH值。（4）保护剂：菌种冷冻真空干燥成功（存活率高、活存期长）的关键在于有效保护剂的使用。目前国内外对乳杆菌等的冻干保护剂研究较多，但对双歧杆菌冻干保护剂研究的报道较少。我们选用新鲜脱脂牛奶作为基础冻干保护剂，得到了较高的存活率。但对冻干保护剂添加何种辅料，各种成分所需佳量等条件还需作进一步研究，以选定出效果好，成本低，安全的干燥菌种冻干保护剂。
（5）干燥好的菌种（尤其双歧杆菌）在取出时对空气中的氧特别敏感，极易死亡从而降低菌种活菌数。
可在干燥制品取出前充入高纯度氮气或直接采用箱内加塞、真空包装等方式解决。
双歧酸奶定量干燥菌种的实验室研究为今后进一步的工作打下了良好的基础，若我们选择合适的包装材料，采用真空冷冻干燥技术进行包装，则可实现干燥菌种的工业袋装化生产。